以1000 ml “MS + 3.0 mg/l NAA + 0.5%（即5 g/l）瓊脂 + 3%（即30 g/l）蔗糖”為例。 **步：準備好配制培養(yǎng)基的一切用具和試劑。 

第二步：稱量5 g瓊脂和30 g蔗糖，溶解在大約所要配制培養(yǎng)基 2/3~3/4左右體積（約600~750 ml）的（蒸餾）水中，加熱溶解，不時攪拌，避免出現瓊脂生塊和泡沫。 

第三步：根據用量，用量簡或移液管從母液中取出所需量的大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質、激素（每做1000 ml培養(yǎng)基，取20 ml大量成分、20 ml氯化鈣母液、10 ml微量成分、10 ml鐵鹽母液和10 ml有機成分，以及3.0 mg NAA），放入預先有少量蒸餾水的燒杯中（以免加藥液時濺出），然后加入瓊脂和糖水溶液中攪拌混勻。 

第四步：加水定容。待攪拌均勻后，用數滴稀堿（NaOH）將pH值調節(jié)到預定水平（一般為pH 5.8），當pH值偏堿時用稀酸（HCl）調節(jié)。用pH試紙或酸堿指示（或pH）計測定培養(yǎng)基的pH值。 

第五步：將培養(yǎng)基用漏斗分裝到培養(yǎng)容器中。每瓶加15~20 ml左右，之后加蓋。 第六步：培養(yǎng)基進行滅菌。高壓蒸氣滅菌鍋的溫度為121℃，滅菌15~20分鐘。 培養(yǎng)基常用高溫高壓（1.06 kg/cm2或0.1 MPa，121℃）蒸氣滅菌的方法，滅菌時間應根據培養(yǎng)瓶體積大小及其內培養(yǎng)基容量多少而定（見表4）。體積和容量越大，所需滅菌時間就越長。空試管、空三角瓶和濾紙要在130℃下滅30分鐘或121℃滅60分鐘。空的培養(yǎng)容器不應同盛裝培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器一起高壓蒸氣滅菌，不同體積培養(yǎng)容器或盛裝不同容量的培養(yǎng)基也不能一起高壓蒸氣滅菌，而應該分別進行。因為熱穿透力是一個需要考慮的因素，體積大的培養(yǎng)容器需要較長的時間滅菌，是因為熱量穿透大體積培養(yǎng)基要比體積小的花更多的時間。利用高壓蒸氣滅菌鍋進行滅菌具有簡單、快速，并且可以附帶殺滅病毒又不吸收的優(yōu)點（與過濾滅茵比較）。其缺點是會引起pH值的變化、發(fā)生化學變化和引起某些化合物的分解，使得某些培養(yǎng)基成分的活性喪失。高壓蒸氣滅菌會引起以下物質分解：蔗糖（分解為葡萄糖和果糖）、秋水仙素、玉米素（核甙）、赤霉酸（90%會喪失反應活性）維生素B1、B12、C和泛酸、抗生素、酶、植物提取液（活性喪失）。所以，原生質體培養(yǎng)用培養(yǎng)基應采用過濾法滅菌。 

表4 培養(yǎng)基或無菌水的**少滅菌時間 

容器分裝體積（mL） 121℃下**少滅菌時間（min） 20~60 15 75~150 20 250~500 25 1000以上 30以上 

過濾滅菌可以除去溶液或液體培養(yǎng)基中直徑大于過濾膜網孔直徑的微粒、微生物和病毒。與高壓蒸氣滅菌法相比，該法不會改變那些在高壓蒸氣滅菌中不穩(wěn)定物質，但是也有些明顯的缺點，如復雜而費時。通常采用0.22~0.45μm孔徑的醋酸纖維素或硝酸纖維素膜篩。對培養(yǎng)基中的不穩(wěn)定成分進行過濾滅菌時，shou先對除不穩(wěn)定成分以外的培養(yǎng)基進行高溫高壓滅菌，滅菌后放置于超凈工作臺中冷卻，溫度降到 40~50℃時，在瓊脂培養(yǎng)基尚未固化之前，在無菌條件下用注射器和無菌微孔濾膜（圖1.7）將高溫不穩(wěn)定物質溶液打入培養(yǎng)基。  

一一一一、、、、培養(yǎng)基的配制與滅菌技術培養(yǎng)基的配制與滅菌技術培養(yǎng)基的配制與滅菌技術培養(yǎng)基的配制與滅菌技術       培養(yǎng)基是將微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質，用人工的方法配制而成的用于培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)基質。培養(yǎng)基種類很多，不同的微生物所需培養(yǎng)基不同。就培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的來源可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基特殊用途可分加富培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基制成后的物理狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入1.5 %-2.0 %瓊脂作凝固劑; 半固體培養(yǎng)基則加入0.5 %-0.8 %的瓊脂。       一般培養(yǎng)基除含有大量水分外, 還含有碳素、氮素、無機鹽類和維生素等。此外, 由于徽生物生長繁殖必須在**適的酸堿度范圍內, 才能表現出**大的生命活力, 因此應根據不同種類的徽生物. 將培養(yǎng)基調節(jié)到一定的pH值范圍。   培養(yǎng)基配制后還必須進行滅菌, 滅菌是指殺死或消滅所有微生物, 包括營養(yǎng)體、孢子和芽孢。滅菌的方法很多，可分為物理方法與化學方法兩大類。物理方法包括濕熱滅菌、干熱滅菌、紫外線滅菌、過濾除菌等; 化學方法主要是利用化學藥品對接種室空間、用具和其它物體表面進行滅菌與消毒。消毒一般是指消滅有害微生物的營養(yǎng)體和病原菌。     ((((一一一一) ) ) ) 培養(yǎng)基的配制方法培養(yǎng)基的配制方法培養(yǎng)基的配制方法培養(yǎng)基的配制方法         一般培養(yǎng)基的配制方法如下 (各種天然培養(yǎng)基的配制方法略有不同)：    l. 按照配方的組分及用量先分別稱量并配成液體； 2. 根據要求調到一定的酸堿度(pH值)； 3. 若要制成固體則加入2%瓊脂并加熱融化； 4. 根據需要的數量分裝入試管或三角瓶中, 加上棉塞或蓋上紗布；    5. 包扎好滅菌后備用。 配制斜面培養(yǎng)基的一般操作步驟為：稱量 → 溶解 → 調pH值 → 加瓊脂 → 過濾 → 分裝 → 加棉塞 → 包扎 → 滅菌 → 擺斜面 → 無菌檢查。 (圖9-7)      ((((二二二二) ) ) ) 培養(yǎng)基及常用器皿的滅菌培養(yǎng)基及常用器皿的滅菌培養(yǎng)基及常用器皿的滅菌培養(yǎng)基及常用器皿的滅菌   培養(yǎng)微生物常用的玻璃器具主要有試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、吸管等, 在使用前必須先進行滅菌, 使容器中不含任何雜菌；培養(yǎng)微生物用的營養(yǎng)基質(培養(yǎng)基), 在接入純種前也必須先行滅菌, 使培養(yǎng)基呈無菌狀態(tài)。培養(yǎng)基可分裝入器皿中一起滅菌, 也可在單獨滅菌后以無菌操作分裝入無菌的器皿中。    1. 棉塞制作與器皿包扎為了避免玻璃器皿在滅菌后再受空氣中雜菌的污染, 仍然能保持無菌狀態(tài), 在滅菌前需進行嚴格的包裝或包扎。試管和三角瓶常采用合適的棉花塞封口 (也可采用金屬、塑料及硅膠帽套), 棉塞起過濾作用，只能讓空氣透過, 而空氣中的微生物則不能通過。制作棉塞應采用普通未脫脂的棉花（醫(yī)用脫脂棉會吸水，不宜采用）, 其制作方法有幾種，可自行靈活掌握。制好的棉塞要求緊貼玻璃壁，沒有皺紋和縫隙； 總長度約為管口直徑的2倍， 插入部分約為2/3, 松緊度合適；外露部分的粗細及結實程度，應合乎一定要求。       若因棉花纖維過短，可在棉塞外面包上1層紗布，便于無菌操作，減少棉塞的污染機率，并可延長棉塞使用時間。新做的棉塞彈性較大，不易定形, 但插在容器上經過一次高壓蒸汽滅菌后，形狀大小即可固定。三角瓶也可用8～12層紗布代替棉塞, 通氣效果更佳。       蒸汽滅菌前, 一般將7-10支試管用繩扎在一起，用牛皮紙包裹棉花塞部分，再用繩扎緊；每個三角瓶可單獨用牛皮紙包扎棉花塞部分, 防止水蒸汽弄濕。 培養(yǎng)皿是專為防止空氣中雜菌的污染而設計的, 底皿加上皿蓋為一套。洗凈烘干后通常每10套疊在一起，用牛皮紙卷成一筒，外面用繩子捆扎以防散開，然后進行滅菌。到使用時，才在超凈工作臺中取出打開。        洗凈烘干的吸管，在吸氣的一端用鑷子或針塞入少許未脫脂棉花(棉花勿外露)，以防止菌體誤吸入洗耳球中，或洗耳球中的微生物通過吸管而進入培養(yǎng)物中造成污染。每支吸管用一條寬約5 cm的紙條，以約45度角螺旋形卷起來，剩余一端折疊打結。滅菌后烘干，使用時才在超凈工作臺中從紙條抽出。    2. 培養(yǎng)基與器皿的高壓蒸汽滅菌       一般培養(yǎng)基、無菌水、耐熱藥物及玻璃器皿等常采用高壓蒸汽滅菌法。該法的優(yōu)點是時間短, 滅菌效果好。它可以殺滅所有的微生物, 包括**耐熱的細菌芽孢及其它休眠體。       一般培養(yǎng)基常用0.1MPa (1 kg/cm2或15 Ib/in2 ), 約120℃維持15-20分鐘, 便可達到徹底滅菌的目的；單獨玻璃器皿滅菌的溫度可高些, 維持的時間可長些。滅菌的溫度及維持的時間, 應隨滅菌物品的性質和容量多少而靈活掌握。要注意滅菌的因素是高溫而不是高壓, 故滅菌鍋內的冷空氣要徹底排除 (在排除冷空氣的條件下, 蒸汽壓與溫度之間有一定關系)，否則, 壓力雖達到0.1Mpa (l kg/cm2 ), 但溫度并沒有達到要求。       實驗室常用的有自控或非自控臥式高壓蒸汽滅菌鍋 (大量滅菌物品時使用), 也有手提式小型滅菌鍋 (見圖3-12)。 3. 玻璃器皿的干熱滅菌         常用玻璃器皿(培養(yǎng)皿、三角燒瓶、試管、吸管等)、金屬器皿及其它干燥耐熱物品, 烘干后經適當包扎(勿裝液體), 可采用干熱滅菌法。干熱滅菌一般在電烘箱內利用干熱空氣滅菌。   該法比濕熱滅菌法所需的溫度要高些 (160-170℃), 時間也要長些 (1-2 h)。但滅菌溫度若超過180℃, 包扎器皿的紙或棉塞就容易燒焦。     二二二二、、、、無菌操作技術無菌操作技術無菌操作技術無菌操作技術       微生物無處不在, 無孔不入, 因此, 在對微生物的研究和應用過程中, 必須隨時注意保持微生物純培養(yǎng)物的純潔性, 防止乃**殺滅其他微生物(雜菌)的混入；在進行分離、轉接及培養(yǎng)微生物純培養(yǎng)物時, 要采用嚴格的無菌操作技術, 防止被其他微生物所污染。       在微生物學研究中, 常需用接種環(huán)把微生物純培養(yǎng)物, 由一個器皿移接到另一個培養(yǎng)容器中進行培養(yǎng)。由于周圍環(huán)境(主要是空氣)中, 存在著大量肉眼無法發(fā)現的各種微生物, 只要一打開器皿，就可能會引起器皿內的培養(yǎng)基或培養(yǎng)物, 被環(huán)境中其他微生物所污染。此外，實驗室人員與所試驗的微生物，應保證沒有或**少直接接觸或氣霧接觸。      因此, 微生物菌種移接的所有操作, 均應在無菌環(huán)境下進行嚴格的無菌操作。    ((((一一一一) ) ) ) 無菌環(huán)境條件無菌環(huán)境條件無菌環(huán)境條件無菌環(huán)境條件     無菌環(huán)境是指在無菌室、無菌箱、超凈工作室或超凈工作臺等無菌或相對無菌的環(huán)境條件下進行操作。     超凈工作室或超凈工作臺目前較常用, 它是用通入經超細過濾的無菌空氣, 以維持其無菌狀態(tài)的；而無菌室或無菌箱目前較少用, 它是在使用前一段時間內, 用紫外線燈或化學藥劑進行室內空氣滅菌, 以維持其相對無菌狀態(tài)的。     紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。紫外線穿透力不強, 所以只適用于無菌室、接種箱和手術室內的空氣及物體表面的滅菌。    ((((二二二二) ) ) ) 無菌操作接種技術無菌操作接種技術無菌操作接種技術無菌操作接種技術     上述的無菌環(huán)境條件只是相對而言, 實際上不可能保持環(huán)境的**無菌。因此接種時, 關鍵是要嚴格進行正確的無菌操作, 其要點是要充分利用酒精燈焰周圍的高溫區(qū)(無菌區(qū)), 即接種時, 管口和瓶口始終保持在火焰 (如酒精燈焰)旁邊, 進行熟練的移接種操作, 以便保證微生物的純種培養(yǎng)。     此外，挑取和移接微生物純培養(yǎng)物用的接種環(huán)及接種針, 應采用易于迅速加熱和冷卻的鎳鉻合金等金屬制備, 使用時用火焰灼燒滅菌；轉移液體純培養(yǎng)物時, 應采用無菌吸管或無菌移液槍。     接種和培養(yǎng)過程中必須保證不被其他微生物所污染, 因此, 除工作環(huán)境要求盡可能地避免或減少雜菌污染外, 熟練地掌握各種無菌操作接種技術是很重要的。常用的無菌接種操作包括斜面接種、穿刺接種和液體培養(yǎng)接種等。穿刺接種操作#p#分頁標題#e#